Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у здоровых добровольцев Юго-Восточной популяции европеоидов Республики Беларусь

Современные фармакогенетические иссле­дования позволили установить наличие инди­видуальной вариабельности реакции организ­ма на действие лекарственных веществ и дру­гих ксенобиотиков, обусловленное генетиче­скими факторами, что во многом определяет ответ на медикаментозное воздействие [1]. В последние годы накопилось большое количе­ство данных о генах, которые кодируют синтез белковых молекул, оказывающих влияние на процессы всасывания, распределения, метабо­лизма и выведения лекарственных средств. В связи с полиморфизмом таких генов у некото­рых пациентов лекарственные препараты мо­гут быть неэффективными или оказывать вы­раженное токсическое воздействие [2-4]. Из­вестно, например, что различные группы паци­ентов могут отличаться по показателям накоп­ления и выведения химических соединений в 10-100 раз. Увеличение эффективности дейст­вия лекарственных препаратов повышает и риск развития побочных эффектов. По данным Аме­риканской медицинской Ассоциации, в США в 1994 г. развитие нежелательных лекарственных реакций стало причиной госпитализации 2 млн человек и 100 тыс. смертельных случаев. По­бочные реакции на прием лекарственных пре­паратов занимают 4-6 места среди причин смерти в США [5]. Экономический ущерб от нежелательных лекарственных реакций вырос с 76,6 в 1997 г. до 177,4 млрд долларов в 2001 г. В то же время эффективность фармакотерапии остается недостаточной. По данным В.М. Silber, на лекарственную терапию не отвечают до 40 % пациентов с различными заболеваниями [6]. Во многом это обусловлено полиморфизмом ге­нов, детерминирующих метаболизм лекарствен­ных средств. Изучение таких генов свидетельст­вует о значительных межпопуляционных и ме­жэтнических особенностях аллельного поли­морфизма, отражающих своеобразие условий проживания, питания и образа жизни людей в различных регионах мира [7-9].

Цель

Провести сравнительный анализ результа­тов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у здоровых добровольцев Юго-Восточного региона Рес­публики Беларусь.

Материалы и методы исследования

В исследовании приняли участие 30 здо­ровых добровольцев Юго-Восточного региона Республики Беларусь. Среди них было 13 (43,33 %) мужчин и 17 (56,67 %) женщин в возрасте от 22 до 55 лет (М = 40,50, 95 % ДИ: 35,00-46,00). Все они не имели клинических симптомов каких-либо заболеваний, являлись европеоидами и не состояли в родстве.

Методика и результаты определения фено­типа ацетилирования представлены в наших предыдущих работах. Быстрый фенотип ацети­лирования имел место у 9 волонтеров (30,0 %), медленный — у 21 (70,0 %) [10, 11].

Определение генотипа NAT2 проведено с помощью метода ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) по­лиморфизма длины рестрикционных фрагментов ампликонов. Генотипический полиморфизм N- ацетилирования изучен по 5 описанным в лите­ратурных источниках однонуклеотидным заме­нам (single nucleotide polymorphism, SNP) [12, 13].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием па­кета прикладных статистических программ «Statistica», 6.0. Соответствие распределения количественных признаков закону нормально­го распределения оценивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Значения показателей представлены как медиана (Ме) и 95 % дове­рительный интервал (95 % ДИ). Для анализа различия частот значения качественного при­знака в одной или в двух и более независимых выборках использовались двусторонний тест точного критерия Фишера и критерий χ2 с по­правкой Йетса. Оценка взаимосвязи количест­венных и (или) качественных признаков про­водилась с помощью ранговой корреляции по Кендаллу (τ). Статистически значимыми счи­тали различия при уровне р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты определения частоты встречаемо­сти полиморфных вариантов гена NAT2 у здоро­вых добровольцев Юго-Восточной области Рес­публики Беларусь и данные по европеоидным по­пуляциям различного этнического и географиче­ского происхождения представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Частоты встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2 у европеоидов Юго­Восточной области Республики Беларусь в сравнении с литературными данными

* Данные представлены в National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snpref.%20cgi?rs=1801280).

Полученные результаты по частоте встре­чаемости полиморфных вариантов гена NAT2 по каждой из 5 SNP для Юго-Восточной попу­ляции европеоидов Республики Беларусь со­гласуются с данными по этим показателям, приведенными Национальным центром по био­технологической информации США (National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA), для европеоидных популяций, относящихся к различным этносам и проживаю­щих в различных географических зонах Север­ной Америки [14].

Результаты определения частоты геноти­пов полиморфных вариантов гена NAT2 среди европеоидов Юго-Восточной популяции Респуб­лики Беларусь и данные по европеоидным попу­ляциям различного этнического и географическо­го происхождения представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Распределение генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 у европеоидов Юго­Восточной популяции Республики Беларусь в сравнении с литературными данными

Полученные результаты по распределению каждого генотипа изучаемых полиморфных ва­риантов гена NAT2 для Юго-Восточной популя­ции европеоидов Республики Беларусь согласу­ются с данными по этим показателям, приведен­ным Национальным центром по биотехнологи­ческой информации США (National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA), для европеоидных популяций, относящихся к раз­личным этносам и проживающих в различных географических зонах Северной Америки [14].

При изучении соответствия фено- и гено­типа ацетилирования с помощью ранговой кор­реляции по методу Кендалла доказана обратная умеренная ассоциация количества мутантных ал­лелей гена NAT2 со скоростью ацетилирования (τ = -0,633, р < 0,0001). Вероятность медленного фенотипа ацетилирования возрастала по мере увеличения количества SNP (τ = -0,657, р < 0,0001).

Среди всех обследованных здоровых доб­ровольцев мутантные аллели отсутствовали у 2 (6,67 %) человек, по 2 SNP имели место у 13 (43,33 %) индивидов и по 4 мутантных аллеля обнаружены у 15 (50,0 %) человек. Из них в группе быстрых ацетиляторов SNP отсутство­вали у 2 (22,22 %) индивидов, по 2 мутантных аллеля выявлены у 7 (77,78 %) человек. В группе медленных ацетиляторов по 2 SNP об­наружены у 6 (28,57 %) индивидов, по 4 му­тантных аллеля выявлены у 15 (71,43 %) чело­век. При сравнении быстрых и медленных аце- тиляторов с использованием двустороннего точного критерия Фишера установлено, что группы имели между собой значимые стати­стические различия по частоте 2 и 4 SNP (р = 0,02 и р = 0,0007 соответственно), а тенденция к увеличению частоты их отсутствия у мед­ленных ацетиляторов статистической значимо­сти не достигла (р = 0,08). Следовательно, му­тантные аллели имели место при любой актив­ности N-ацетилтрансферазы. Однако присут­ствие 4 SNP указывало на наличие медленного фенотипа ацетилирования. Полученные данные согласуются с результатами исследования дру­гих авторов. Например, в исследовании С. И. Ма­каровой с соавт., начиная с 3 SNP, не было выяв­лено ни одного индивида с фенотипом быстрого ацетилятора. Точность прогноза при этом, по мнению исследователей, повышало определение замены в 481-м положении [15].

Таким образом, одновременная оценка не­скольких SNP в гене NAT2 повышает точность прогноза фенотипа ацетилирования, но даже одновременная оценка 5 SNP не позволяет одно­значно предсказать фенотип ацетилятора. По мнению большинства исследователей, такое не­соответствие между гено- и фенотипом обосно­вано смещением генотипа быстрого ацетилиро­вания в область фенотипа медленного ацетили­рования. Например, в работе И. В. Голденковой- Павловой с соавторами полная конкордант- ность между фено- и генотипом ацетилирова­ния у волонтеров Московской популяции ус­тановлена только в 85 % случаев. Исследова­тели показали, что в ряде случаев быстрый ге­нотип ацетилирования по фенотипированию имел количественные данные, соответство­вавшие медленному фенотипу [13]. В. А. Ва­вилин с соавторами в группе пациентов с ту­беркулезом легких по той же причине зафик­сировал 26 % отклонений реальных фенотипов ацетилирования от ожидаемых на основе гене­тических оценок [16]. Основной причиной ус­тановленных несоответствий в изучаемых по­пуляционных выборках, по мнению исследова­телей, могут являться другие, еще неизучен­ные аллели с иным сочетанием мутаций, кото­рые способны повлиять на согласованность ре­зультатов гено- и фенотипирования [17]. Сле­довательно, определение ацетиляторного ста­туса путем фенотипирования позволяло за од­нократное измерение суммировать все сущест­вующие полиморфизмы и количественно уста­новить активность ацетилтрансферазы у кон­кретного индивида. В связи с этим определе­ние ацетиляторного фенотипа было эффектив­нее для количественной оценки скорости аце­тилирования и уточнения риска токсичности или ожидаемого терапевтического эффекта от применения лекарственных средств, метаболи­зирующихся путем ацетилирования. В свою очередь, генотипирование позволяло точно выявлять аллели и генотипы, а также их рас­пределение в популяционных выборках. Это создало возможность проводить популяцион­ные исследования полиморфизма гена NAT2 без фенотипирования, в том числе и с целью обнаружения ассоциаций между генотипом ацетилирования и предрасположенностью от­дельного индивида к развитию заболеваний.

Заключение

Впервые в Республике Беларусь проведено генотипирование по полиморфизму N-ацетили­рования. Доказано, что одновременная оценка 5 SNP не позволяет однозначно предсказать фено­тип ацетилятора. Следовательно, в настоящее время генотипирование позволяет точно выяв­лять аллели и генотипы, их распределение в по­пуляционных выборках, но не позволяет в отли­чие от фенотипирования за однократное изме­рение суммировать все существующие полимор­физмы и количественно установить активность ацетилтрансферазы у конкретного индивида. Это создает возможность использовать генотипирова­ние для популяционных исследований полимор­физма гена NAT2 без фенотипирования, в том числе и с целью обнаружения ассоциаций между генотипом ацетилирования и предрасположенно­стью отдельного индивида к развитию заболева­ний. В то же время определение ацетиляторного фенотипа эффективнее для количественной оцен­ки скорости ацетилирования и уточнения риска токсичности или ожидаемого терапевтического эффекта от применения лекарственных средств, метаболизирующихся путем ацетилирования.

Выводы

1. Мутантные аллели имели место при любой активности N-ацетилтрансферазы (р = 0,08). Коли­чество мутантных аллелей гена NAT2 показали прямую обратную умеренную ассоциацию со ско­ростью ацетилирования (τ = -0,633, р < 0,0001).
2. Вероятность медленного фенотипа аце­тилирования возрастала по мере увеличения количества SNP (τ = -0,657, р < 0,0001), а при­сутствие 4 однонуклеотидных замен указывало с высокой степенью достоверности на медлен­ный фенотип ацетилирования (р = 0,0007).

Библиографический список

1. Клиническая фармакология и фармакотерапия / В. Г. Кукес [и др.]; под ред. В. Г. Кукеса, А. К. Стародубцева. — 2-е изд., испр. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 640 с.
2. Marsh, S. Global pharmacogenetics: giving the genome to the masses / S. Marsh, D. J. van Booven, H. L. McLeod // Pharmaco- genomics. — 2006. — Vol. 7, № 4. — P. 625-631.
3. Polymorphism discovery in 51 chemotherapy pathway genes / R. R. Freimuth [et. al.] // Hum. Mol. Genet. — 2005. — Vol. 14, № 23. — P. 3595-3603.
4. Кукес, В. Г. Метаболизм лекарственных средств: клини­ко-фармакологические аспекты / В. Г. Кукес. — М.: Реафарм, 2004. — 144 c.
5. Clinical pharmacogenetics of the biotransformation system and carriers of medications: the fashion or the applied direction? / D. A. Sy­chev [et al.] // Pacific Medical Journal. — 2006. — Vol. 4. — P. 21-26.
6. Pharmacogenomics / B. M. Silber [et. al.]. — New York: Marcel Dekker, 2001. — 214 p.
7. Баранов, В. Гены детоксикации, ответственные за био­трансформацию ксенобиотиков / В. Баранов // Молекулярная биология. — 2000. — Т. 34, № 4. — С. 686.
8. Pirmohamed, M. Association analysis of drug metabolizing enzyme gene in clinical practice / M. Pirmohamed // Intern. Med. J. — 2001. — Vol. 31, № 8. — P. 476-478.
9. Polymorphism in HIV-positive patients wish co-trimoxazole hypersensitivity / M. Pirmohamed [et. al.] // Pharmacogenetics. — 2000. — Vol. 10, № 8. — P. 705-713.
10. Сатырова, Т. В. Вариабельность фенотипа N-ацетил­трансферазы у жителей г. Гомеля и Гомельской области / Т. В. Са- тырова [и др.] // Проблемы здоровья и экологии. — 2010. — № 1(23). — С. 73-77.
11. Сатырова, Т. В. Фенотипический полиморфизм фер­мента N-ацетилтрансферазы 2 у больных ЯК / Т. В. Сатырова, Е. И. Михайлова // Медицинская панорама. — 2010. — № 3 (111). — С. 35-37.
12. High-Throughput genomic and proteomic analysis using microarray technology / J. X. Huang [et al.] // Clin. Chemistry. — 2001. — Vol. 47. — P. 1912-1916.
13. Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у челове­ка / И. В. Голденкова-Павлова [и др.] // Генетика. — 2006. — Т. 42, № 8. — С. 1143-1150.
14. National Center for Biotechnology Information. GenBank, NIH genetic sequence database [Electronic resourse] / United States National Library of Medicine (NLM), a branch of the National Insti­tutes of Health. — Bethesda, Maryland, 1988. — Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snpref.cgi?rs=1801280. — Date of access: 19.11.2010.
15. Макарова, С. И. Соответствие генотипа и фенотипа ацетилирования / С. И. Макарова, В. А. Вавилин, А. В. Кудря­шов // Фармакогенетика. — 2006. — № 6. — С. 37-39.
16. Полиморфизм NAT2, фармакокинетика изониазида и гепатотоксические реакции у больных туберкулезом легких / В. А. Вавилин [и др.] // Материалы Междунар. конф., Новосибирск, 2-8 сент. 2007 / Новосибирский НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. — С. 18.
17. Single-nucleotide polymorphisms can cause different struc­tural folds of mRNA / L. X. Shen [et al.] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 7871-7876.

Авторы: Т.В. Сатырова, Е.И. Михайлова, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев, О.В. Осипкина
Источник: Проблемы здоровья и экологии. — 2015. — № 4(46). — С. 32-36.