Современные фармакогенетические исследования позволили установить наличие индивидуальной вариабельности реакции организма на действие лекарственных веществ и других ксенобиотиков, обусловленное генетическими факторами, что во многом определяет ответ на медикаментозное воздействие [1]. В последние годы накопилось большое количество данных о генах, которые кодируют синтез белковых молекул, оказывающих влияние на процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственных средств. В связи с полиморфизмом таких генов у некоторых пациентов лекарственные препараты могут быть неэффективными или оказывать выраженное токсическое воздействие [2-4]. Известно, например, что различные группы пациентов могут отличаться по показателям накопления и выведения химических соединений в 10-100 раз. Увеличение эффективности действия лекарственных препаратов повышает и риск развития побочных эффектов. По данным Американской медицинской Ассоциации, в США в 1994 г. развитие нежелательных лекарственных реакций стало причиной госпитализации 2 млн человек и 100 тыс. смертельных случаев. Побочные реакции на прием лекарственных препаратов занимают 4-6 места среди причин смерти в США [5]. Экономический ущерб от нежелательных лекарственных реакций вырос с 76,6 в 1997 г. до 177,4 млрд долларов в 2001 г. В то же время эффективность фармакотерапии остается недостаточной. По данным В.М. Silber, на лекарственную терапию не отвечают до 40 % пациентов с различными заболеваниями [6]. Во многом это обусловлено полиморфизмом генов, детерминирующих метаболизм лекарственных средств. Изучение таких генов свидетельствует о значительных межпопуляционных и межэтнических особенностях аллельного полиморфизма, отражающих своеобразие условий проживания, питания и образа жизни людей в различных регионах мира [7-9].
Цель
Провести сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у здоровых добровольцев Юго-Восточного региона Республики Беларусь.
Материалы и методы исследования
В исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев Юго-Восточного региона Республики Беларусь. Среди них было 13 (43,33 %) мужчин и 17 (56,67 %) женщин в возрасте от 22 до 55 лет (М = 40,50, 95 % ДИ: 35,00-46,00). Все они не имели клинических симптомов каких-либо заболеваний, являлись европеоидами и не состояли в родстве.
Методика и результаты определения фенотипа ацетилирования представлены в наших предыдущих работах. Быстрый фенотип ацетилирования имел место у 9 волонтеров (30,0 %), медленный — у 21 (70,0 %) [10, 11].
Определение генотипа NAT2 проведено с помощью метода ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ампликонов. Генотипический полиморфизм N- ацетилирования изучен по 5 описанным в литературных источниках однонуклеотидным заменам (single nucleotide polymorphism, SNP) [12, 13].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных статистических программ «Statistica», 6.0. Соответствие распределения количественных признаков закону нормального распределения оценивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Значения показателей представлены как медиана (Ме) и 95 % доверительный интервал (95 % ДИ). Для анализа различия частот значения качественного признака в одной или в двух и более независимых выборках использовались двусторонний тест точного критерия Фишера и критерий χ2 с поправкой Йетса. Оценка взаимосвязи количественных и (или) качественных признаков проводилась с помощью ранговой корреляции по Кендаллу (τ). Статистически значимыми считали различия при уровне р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты определения частоты встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2 у здоровых добровольцев Юго-Восточной области Республики Беларусь и данные по европеоидным популяциям различного этнического и географического происхождения представлены в таблице 1.
Таблица 1 — Частоты встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2 у европеоидов ЮгоВосточной области Республики Беларусь в сравнении с литературными данными
Аллель | Частоты аллелей | |
результаты исследования | данные литературных источников* | |
857A | 0,033 | 0,017-0,114 |
481T | 0,417 | 0,375-0,485 |
282T | 0,300 | 0,265-0,310 |
341C | 0,417 | 0,262-0,442 |
590A | 0,267 | 0,268-0,333 |
* Данные представлены в National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snpref.%20cgi?rs=1801280).
Полученные результаты по частоте встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2 по каждой из 5 SNP для Юго-Восточной популяции европеоидов Республики Беларусь согласуются с данными по этим показателям, приведенными Национальным центром по биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA), для европеоидных популяций, относящихся к различным этносам и проживающих в различных географических зонах Северной Америки [14].
Результаты определения частоты генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 среди европеоидов Юго-Восточной популяции Республики Беларусь и данные по европеоидным популяциям различного этнического и географического происхождения представлены в таблице 2.
Таблица 2 — Распределение генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 у европеоидов ЮгоВосточной популяции Республики Беларусь в сравнении с литературными данными
Генотип | Результаты исследования, частота | Литературные данные, частота |
G857A |
||
GG | 0,933 | 0,958-0,967 |
GA | 0,067 | 0,033-0,042 |
C481T |
||
CC | 0,333 | 0,206-0,417 |
CT | 0,500 | 0,417-0,618 |
TT | 0,167 | 0,153-0,176 |
C282T |
||
CC | 0,500 | 0,500-0,559 |
CT | 0,400 | 0,353-0,376 |
TT | 0,100 | 0,088-0,121 |
T341C |
||
TT | 0,333 | 0,300-0,476 |
TC | 0,500 | 0,517-0,524 |
CC | 0,167 | 0,183 |
G590A |
||
GG | 0,533 | 0,458-0,533 |
GA | 0,400 | 0,350-0,417 |
AA | 0,067 | 0,117-0,125 |
Полученные результаты по распределению каждого генотипа изучаемых полиморфных вариантов гена NAT2 для Юго-Восточной популяции европеоидов Республики Беларусь согласуются с данными по этим показателям, приведенным Национальным центром по биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information, Genn Bank, USA), для европеоидных популяций, относящихся к различным этносам и проживающих в различных географических зонах Северной Америки [14].
При изучении соответствия фено- и генотипа ацетилирования с помощью ранговой корреляции по методу Кендалла доказана обратная умеренная ассоциация количества мутантных аллелей гена NAT2 со скоростью ацетилирования (τ = -0,633, р < 0,0001). Вероятность медленного фенотипа ацетилирования возрастала по мере увеличения количества SNP (τ = -0,657, р < 0,0001).
Среди всех обследованных здоровых добровольцев мутантные аллели отсутствовали у 2 (6,67 %) человек, по 2 SNP имели место у 13 (43,33 %) индивидов и по 4 мутантных аллеля обнаружены у 15 (50,0 %) человек. Из них в группе быстрых ацетиляторов SNP отсутствовали у 2 (22,22 %) индивидов, по 2 мутантных аллеля выявлены у 7 (77,78 %) человек. В группе медленных ацетиляторов по 2 SNP обнаружены у 6 (28,57 %) индивидов, по 4 мутантных аллеля выявлены у 15 (71,43 %) человек. При сравнении быстрых и медленных аце- тиляторов с использованием двустороннего точного критерия Фишера установлено, что группы имели между собой значимые статистические различия по частоте 2 и 4 SNP (р = 0,02 и р = 0,0007 соответственно), а тенденция к увеличению частоты их отсутствия у медленных ацетиляторов статистической значимости не достигла (р = 0,08). Следовательно, мутантные аллели имели место при любой активности N-ацетилтрансферазы. Однако присутствие 4 SNP указывало на наличие медленного фенотипа ацетилирования. Полученные данные согласуются с результатами исследования других авторов. Например, в исследовании С. И. Макаровой с соавт., начиная с 3 SNP, не было выявлено ни одного индивида с фенотипом быстрого ацетилятора. Точность прогноза при этом, по мнению исследователей, повышало определение замены в 481-м положении [15].
Таким образом, одновременная оценка нескольких SNP в гене NAT2 повышает точность прогноза фенотипа ацетилирования, но даже одновременная оценка 5 SNP не позволяет однозначно предсказать фенотип ацетилятора. По мнению большинства исследователей, такое несоответствие между гено- и фенотипом обосновано смещением генотипа быстрого ацетилирования в область фенотипа медленного ацетилирования. Например, в работе И. В. Голденковой- Павловой с соавторами полная конкордант- ность между фено- и генотипом ацетилирования у волонтеров Московской популяции установлена только в 85 % случаев. Исследователи показали, что в ряде случаев быстрый генотип ацетилирования по фенотипированию имел количественные данные, соответствовавшие медленному фенотипу [13]. В. А. Вавилин с соавторами в группе пациентов с туберкулезом легких по той же причине зафиксировал 26 % отклонений реальных фенотипов ацетилирования от ожидаемых на основе генетических оценок [16]. Основной причиной установленных несоответствий в изучаемых популяционных выборках, по мнению исследователей, могут являться другие, еще неизученные аллели с иным сочетанием мутаций, которые способны повлиять на согласованность результатов гено- и фенотипирования [17]. Следовательно, определение ацетиляторного статуса путем фенотипирования позволяло за однократное измерение суммировать все существующие полиморфизмы и количественно установить активность ацетилтрансферазы у конкретного индивида. В связи с этим определение ацетиляторного фенотипа было эффективнее для количественной оценки скорости ацетилирования и уточнения риска токсичности или ожидаемого терапевтического эффекта от применения лекарственных средств, метаболизирующихся путем ацетилирования. В свою очередь, генотипирование позволяло точно выявлять аллели и генотипы, а также их распределение в популяционных выборках. Это создало возможность проводить популяционные исследования полиморфизма гена NAT2 без фенотипирования, в том числе и с целью обнаружения ассоциаций между генотипом ацетилирования и предрасположенностью отдельного индивида к развитию заболеваний.
Заключение
Впервые в Республике Беларусь проведено генотипирование по полиморфизму N-ацетилирования. Доказано, что одновременная оценка 5 SNP не позволяет однозначно предсказать фенотип ацетилятора. Следовательно, в настоящее время генотипирование позволяет точно выявлять аллели и генотипы, их распределение в популяционных выборках, но не позволяет в отличие от фенотипирования за однократное измерение суммировать все существующие полиморфизмы и количественно установить активность ацетилтрансферазы у конкретного индивида. Это создает возможность использовать генотипирование для популяционных исследований полиморфизма гена NAT2 без фенотипирования, в том числе и с целью обнаружения ассоциаций между генотипом ацетилирования и предрасположенностью отдельного индивида к развитию заболеваний. В то же время определение ацетиляторного фенотипа эффективнее для количественной оценки скорости ацетилирования и уточнения риска токсичности или ожидаемого терапевтического эффекта от применения лекарственных средств, метаболизирующихся путем ацетилирования.
Выводы
- Мутантные аллели имели место при любой активности N-ацетилтрансферазы (р = 0,08). Количество мутантных аллелей гена NAT2 показали прямую обратную умеренную ассоциацию со скоростью ацетилирования (τ = -0,633, р < 0,0001).
- Вероятность медленного фенотипа ацетилирования возрастала по мере увеличения количества SNP (τ = -0,657, р < 0,0001), а присутствие 4 однонуклеотидных замен указывало с высокой степенью достоверности на медленный фенотип ацетилирования (р = 0,0007).
Библиографический список
- Клиническая фармакология и фармакотерапия / В. Г. Кукес [и др.]; под ред. В. Г. Кукеса, А. К. Стародубцева. — 2-е изд., испр. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 640 с.
- Marsh, S. Global pharmacogenetics: giving the genome to the masses / S. Marsh, D. J. van Booven, H. L. McLeod // Pharmaco- genomics. — 2006. — Vol. 7, № 4. — P. 625-631.
- Polymorphism discovery in 51 chemotherapy pathway genes / R. R. Freimuth [et. al.] // Hum. Mol. Genet. — 2005. — Vol. 14, № 23. — P. 3595-3603.
- Кукес, В. Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты / В. Г. Кукес. — М.: Реафарм, 2004. — 144 c.
- Clinical pharmacogenetics of the biotransformation system and carriers of medications: the fashion or the applied direction? / D. A. Sychev [et al.] // Pacific Medical Journal. — 2006. — Vol. 4. — P. 21-26.
- Pharmacogenomics / B. M. Silber [et. al.]. — New York: Marcel Dekker, 2001. — 214 p.
- Баранов, В. Гены детоксикации, ответственные за биотрансформацию ксенобиотиков / В. Баранов // Молекулярная биология. — 2000. — Т. 34, № 4. — С. 686.
- Pirmohamed, M. Association analysis of drug metabolizing enzyme gene in clinical practice / M. Pirmohamed // Intern. Med. J. — 2001. — Vol. 31, № 8. — P. 476-478.
- Polymorphism in HIV-positive patients wish co-trimoxazole hypersensitivity / M. Pirmohamed [et. al.] // Pharmacogenetics. — 2000. — Vol. 10, № 8. — P. 705-713.
- Сатырова, Т. В. Вариабельность фенотипа N-ацетилтрансферазы у жителей г. Гомеля и Гомельской области / Т. В. Са- тырова [и др.] // Проблемы здоровья и экологии. — 2010. — № 1(23). — С. 73-77.
- Сатырова, Т. В. Фенотипический полиморфизм фермента N-ацетилтрансферазы 2 у больных ЯК / Т. В. Сатырова, Е. И. Михайлова // Медицинская панорама. — 2010. — № 3 (111). — С. 35-37.
- High-Throughput genomic and proteomic analysis using microarray technology / J. X. Huang [et al.] // Clin. Chemistry. — 2001. — Vol. 47. — P. 1912-1916.
- Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека / И. В. Голденкова-Павлова [и др.] // Генетика. — 2006. — Т. 42, № 8. — С. 1143-1150.
- National Center for Biotechnology Information. GenBank, NIH genetic sequence database [Electronic resourse] / United States National Library of Medicine (NLM), a branch of the National Institutes of Health. — Bethesda, Maryland, 1988. — Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snpref.cgi?rs=1801280. — Date of access: 19.11.2010.
- Макарова, С. И. Соответствие генотипа и фенотипа ацетилирования / С. И. Макарова, В. А. Вавилин, А. В. Кудряшов // Фармакогенетика. — 2006. — № 6. — С. 37-39.
- Полиморфизм NAT2, фармакокинетика изониазида и гепатотоксические реакции у больных туберкулезом легких / В. А. Вавилин [и др.] // Материалы Междунар. конф., Новосибирск, 2-8 сент. 2007 / Новосибирский НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. — С. 18.
- Single-nucleotide polymorphisms can cause different structural folds of mRNA / L. X. Shen [et al.] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 7871-7876.
Авторы: Т.В. Сатырова, Е.И. Михайлова, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев, О.В. Осипкина
Источник: Проблемы здоровья и экологии. — 2015. — № 4(46). — С. 32-36.